商品屬性：

描述：BL21(DE3) Chaprone 感受態細胞中含有分子伴侶蛋 白質粒，其表達產物可協助重組蛋白正確折疊形成可溶活性 蛋白。分子伴侶蛋白質粒為抗性（chloramphenicol， Cmr）的表達受控于四環素（tetR）操縱子，因此該感受態 不適用于抗性表達質粒的轉化。 本品使用  的化學感受態技術制備， 其室溫可保存 3 天、-20°C 可保存 2 年（推薦保存溫度）、 -80°C 可長期保存性能無下降。運輸過程中無需干冰，可常 規冰袋運輸（推薦運輸溫度）。該感受態細胞為熱激感受態 細胞，轉用于蛋白表達（不可用于克隆和載體構建），經 42°C 熱激 1min 可獲得 105～106 cfu/μg 效價，可滿足質粒轉化要 求。該制品使用簡單、運輸、儲存方便。 

組分
RTS BL21(DE3)Chaprone Competent Cell（10T） 1 瓶
Nano E.coli Transfection Reagent 1 mL
儲存：RTS 系列感受態為干粉形式，均可室溫保存 3 天，長期保存-20°C（2 年）。經 Nano E.coli Transfection Reagent溶解后的感受態必須分裝后，并于-60°C 以下保存。溶解后的感受態細胞避免反復凍融，在-60°C 以下可保存 6 個月。
操作方法
1. 從-20°C 冰箱中取出 Nano E.coli Transfection Reagent融化，放置于冰上。取 300 μl Nano E.coli TransfectionReagent 加入到一支凍干感受態細胞中，并分裝到 10 支 1.5ml EP 管中（每支 30 μl），于-60°C 以下保存（或立即使用）。
2. 將 10～100 ng 質粒 DNA（不可使用連接產物、不可使用篩選標記質粒）加入到分裝的感受態細胞中，輕彈EP 管（或槍頭輕輕吹打），置于冰上 15min。
3. 置于 42°C 熱激 1 min 后，迅速置于冰上急冷 2 min。
4. 熱激完畢后，向上述感受態細胞中加入 450 μL 不含抗生素的 SOC（或 LB）培養基，37 °C 振蕩（225 rpm）培養60 min。使質粒上抗性標記基因表達，菌體復蘇。
5. 取200 μl復蘇菌液涂布到含相應抗生素的LB瓊脂平板表面。（含相應質?？股睾?20 μg/ml ）
6. 將平板置于 37 °C 培養，12~18 小時后可出現菌落。
7. 挑選生長良好的菌落，接入 LB 培養基（含相應質粒抗生素，20 μg/ml），37 ℃劇烈振蕩培養過夜。
8. 1/50 比例接入新的 LB 培養基（含相應質?？股?，20μg/ml ，0.5 mg/ml L-阿拉伯糖）37 ℃劇烈振蕩培養至菌體密度 OD600 約 0.3（約 2h）。
9. 加入終濃度 2 ng/ml 四環素（誘導 chaprone 伴侶蛋白表達），37℃劇烈振蕩培養至 OD600 約 0.5（約 2~4h）。
10. 加入適量 IPTG(0.1-1 mM), 15℃振蕩培養 24h（培養搖床無法制冷條件下，室溫誘導 8～12h）。
11. 4,000 rpm 室溫離心 15 min，收集細胞，進行蛋白表達和可溶性表達分析。

PCR基本步驟及注意事項？

一、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法，它類似于生物體內DNA的復制。在生物體內DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應同樣需要類似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列，實現對特定位置的擴增；PCR Buffer提供一個反應的緩沖環境；反應過程同生物體內一樣，DNA雙鏈打開，引物結合模板，延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過控制反應溫度實現的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈，在退火溫度處引物結合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復重復此過程即可實現對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環開始才產生出和靶DNA區段相同的DNA分子，進一步循環地產生出靶DNA區段的指數加倍。

在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環數而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續大量擴增，達到較高水平。因此，應適當調節循環次數，在平臺期前結束反應， 減少非特異性產物。到達平臺期(Plateau)所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產物，cDNA等，但不能為RNA。對于不同類型的模板，其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠，質粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產物預變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過在第一輪循環時只有一個引物結合，合成另一條鏈。從第二輪開始，兩個引物均與特異位點結合，從而實現了與常規PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增，原因就在于實現PCR反應的是DNA聚合酶，只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來說，一般25ul體系DNA的質量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜，提取的濃度也往往比較大，為防止濃度過大對PCR造成影響，故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質粒及PCR產物由于其結構簡單，且提取濃度一般較低，則無需稀釋。

PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結果遇到沒有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環數不夠(一般不超過45循環,不僅背景值提高,定量也不準);

2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解。可通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發生模板降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環, 否則定量不準確。

因此,判斷Ct值出現過晚是否屬于非正常情況, 需要根據具體實驗設計和目的進行。

1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。

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